三种southern杂交转膜方法的比较-钟鼎生物
本文介绍了三种southern杂交中转膜的方法，即向下转移法、电转移法、真空转移法，各自介绍了他们的原理、实验步骤并比较了这三种方法的优缺点，仅供参考。
1.向下转移法
向下转移法的一个缺点就是胶容易被重物压碎。随着转移进行，由于滤纸长时间浸泡，导致胶承受的压力越来越大，胶更容易碎，更容易延长转膜时间，常常导致转移时间 长达16-24 h。所以我们推荐一种向下转移法，如下图。
向下转移法通常只需要1 h,适用于各种不同类型的膜，而且还可用高盐或碱件转移缓冲液。以下简介这种方法。
(1)如前所述准备好胶。
(2)在一个玻璃皿中准备好纸巾，要略微大于胶。
(3)按照下图所示，安装好装置。首先将4张滤纸置于纸巾上，用转移液浸润并使其淹过最高点。同时将膜如向上转移法同样处理。膜可以稍微比胶大。
(4)将膜置于顶层滤纸上，轻轻用玻棒赶走气泡。同样地要用塑料膜铺在胶周边，以避免短路。
(5)将胶置于膜上，轻轻赶去气泡。（切勿使胶触及膜的边缘）
(6)将被转移液浸润的滤纸剪成胶样大小，铺于胶上，再铺2张较大的滤纸，如图所示，再将装有转移缓冲液的玻璃皿置于一支持物上，大滤纸另端浸润在转移缓冲液中，如图形成盐桥。
(7)在滤纸上铺上一层保鲜膜，以减少蒸发，再在上加一玻璃板。静置1h。
(8)移去纸巾滤纸等。后续步骤如向上转移法。
2.电转移法
此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶于滤膜一起置于滤纸之间，固定与凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹，如下图所示。该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。一般只需2-3h至多6-8h即可完成转移过程。但在southern杂交中应用这种方法需注意：不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物；应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液温度不会太高；转移缓冲液不能用高盐缓冲液，以免产生强电流破坏DNA。具体步骤如下：
按前述毛细管法操作酶切、电泳、变性和中和。
(1)将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
(2)准备好电转移装置的凝胶支持夹裁剪4张与凝胶大小相同的Whatman 3 mm滤纸和一张尼龙膜浸泡于1×TBE或TAE中。
(3)依次将凝胶、尼龙膜、滤纸和海绵垫叠放在凝胶支持夹中，各层之间不能有气泡滞留。
(4)将凝胶支持夹安放在充满1×TBE或TAE的电转仪中。
(5)尼龙膜一侧置正极，凝胶一侧置负极，300-600mA恒流，4-8h，循环水冷却或置冷室中。
(6)电转移完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，用干燥滤纸吸干，80℃真空烘烤2h或短波紫外照射固定备用。
3.真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下,凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的固相支持物——尼龙膜或硝酸纤维素膜上。具体步骤如下：
(1)电泳完毕，可以先行脱嘌呤、碱变性，也可以直接进行转移。
(2)在真空转移仪的真空密封膜上剪一与凝胶大小相同或者稍小的窗口。
(3)剪一与凝胶大小相同或稍大的Whatman 3 mm滤纸，用双蒸水浸润，置于上述窗口上。
(4)剪一与凝胶大小相同的尼龙膜或者硝酸纤维索膜，用双蒸水浸润，置于滤纸上, 用玻棒赶去气泡。
(5)将凝胶置于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，赶去气泡。
(6)将真空转移仪封严，用Parafilm封牢凝胶周围，使之不会漏气。
(7)接通真空泵，真空压约5.88 kPa，压力过高，如超过5.88 kPa,则凝胶被压缩, 转移效率反而降低。用变性液覆盖满凝胶，抽气约15 min,随时添加变性缓冲液。
(8)换用中和液，继续抽气约15 min。
(9)转移完毕，硝酸纤维素膜或尼龙膜用去离子水漂洗，然后固定。
真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和，整个过程约需 :30〜60 min。但在操作中应注意两个问题：一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。以下展示southern杂交中三种转膜方法的优劣。
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southern印迹杂交结果注意
在进行Southern印迹杂交实验时，观察到阳性反应呈现出明显的带状分布。转膜过程至关重要，确保DNA完全转移到膜上是必不可少的步骤。杂交条件和漂洗步骤对于获得清晰的阳性结果以及良好的背景对比至关重要。如果漂洗不彻底，可能会导致背景信号过强；相反，过度漂洗则可能掩盖真正的阳性信号，造成假阴性结果。在...
为什么电泳后要转膜? 直接染色或荧光标记检测不可以吗?
抗体需要孵育 直接在胶上的话蛋白早就扩散没了 而且胶各种不方便 容易破碎啥的 当然转到膜上方便啊
DNA杂交技术是用目的基因与非目的基因杂交?
Southern Blot：DNA片段通过电泳跑胶分开后，转到膜上。用一段探针（用同位素或者荧光标记）去和目标片段杂交。如果膜上有目标片段，探针就会结合到膜上的特定位置，显影后形成一个条带，条带的大小和目标基因的多少有关。基因文库筛选：转染文库质粒的细菌涂盘生长后，形成克隆。克隆转膜后，用探针去结合...
Southern杂交实验转移DNA之前为什么要对胶做酸碱处理?
1 打断DNA，方便转膜（分子太大不好转）2 搭桥关键不要短路
为什么western blot 及southern blot电泳后都要转膜?
southern其实都是要做标记的。因为样品是很多蛋白（western）或DNA（southern）的混合物，而我们只要看其中的目的条带，所以必须用特定的方法把目的条带标记出来，而其他的条带不显示（比如western的抗原抗体标记，southern的放射性自显影）。这种标记必须在膜上进行，不能直接在胶上进行，所以电泳后必须转膜...
blot实验技术的介绍
Blot技术，如同一幅科学地图，被划分为DNA（Southern Blot）、RNA（Northern Blot）、蛋白质（Western Blot）和蛋白修饰（Eastern Blot，少见但与Western Blot密切相关）四大区域，各自专注于不同的生物大分子检测。S··B··南方的南方Blot，巧妙地结合了核酸杂交与碱基互补原理，实现基因和蛋白的双重检测...
southern杂交的阳性对照浓度
可以采用质粒DNA作为阳性对照。选择合适的酶进行单酶切，将环状DNA切成直链。在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题，转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。若用到有毒物质，必需注意环保...
NC转印膜在生物实验中的具体应用怎样
在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot中都需要用到NC膜，杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜。 固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过...
应用基因重排技术诊断淋巴瘤
但发生过基因重排的细胞DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在(1~5)，克隆性的基因重排条带就可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。Southern分析已被应用于IgH、Igk...
请问什么是:reverse northern blot
反向Northern杂交分析 反向Northern Blotting是将经差异显示得到的扩增后的DNA片段转膜，并分别与来自两个不同细胞系总RNA经反转录制备的32P标记的cDNA第一链探针(reverse transcribed 32P-cDNA prob)进行杂交。
1.向下转移法
向下转移法的一个缺点就是胶容易被重物压碎。随着转移进行，由于滤纸长时间浸泡，导致胶承受的压力越来越大，胶更容易碎，更容易延长转膜时间，常常导致转移时间 长达16-24 h。所以我们推荐一种向下转移法，如下图。
向下转移法通常只需要1 h,适用于各种不同类型的膜，而且还可用高盐或碱件转移缓冲液。以下简介这种方法。
(1)如前所述准备好胶。
(2)在一个玻璃皿中准备好纸巾，要略微大于胶。
(3)按照下图所示，安装好装置。首先将4张滤纸置于纸巾上，用转移液浸润并使其淹过最高点。同时将膜如向上转移法同样处理。膜可以稍微比胶大。
(4)将膜置于顶层滤纸上，轻轻用玻棒赶走气泡。同样地要用塑料膜铺在胶周边，以避免短路。
(5)将胶置于膜上，轻轻赶去气泡。（切勿使胶触及膜的边缘）
(6)将被转移液浸润的滤纸剪成胶样大小，铺于胶上，再铺2张较大的滤纸，如图所示，再将装有转移缓冲液的玻璃皿置于一支持物上，大滤纸另端浸润在转移缓冲液中，如图形成盐桥。
(7)在滤纸上铺上一层保鲜膜，以减少蒸发，再在上加一玻璃板。静置1h。
(8)移去纸巾滤纸等。后续步骤如向上转移法。
2.电转移法
此法是通过电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本方法是将滤膜与凝胶贴在一起，并将凝胶于滤膜一起置于滤纸之间，固定与凝胶支持夹，将支持夹置于盛有转移电泳缓冲液的转移电泳槽中，凝胶平面与电场方向垂直，附有滤膜的一面朝向正极。在电场的作用下凝胶中的DNA片段向与凝胶平面垂直的方向泳动，从凝胶中移出，滞留在滤膜上形成印迹，如下图所示。该法具有简单、快速、高效转移DNA的特点，尤其适用于用毛细管虹吸转移不理想的大片段DNA。一般只需2-3h至多6-8h即可完成转移过程。但在southern杂交中应用这种方法需注意：不能选用硝酸纤维素膜作为固相支持物；应用循环冷却水装置以保证转移缓冲液温度不会太高；转移缓冲液不能用高盐缓冲液，以免产生强电流破坏DNA。具体步骤如下：
按前述毛细管法操作酶切、电泳、变性和中和。
(1)将凝胶浸泡于1×TBE或TAE中。
(2)准备好电转移装置的凝胶支持夹裁剪4张与凝胶大小相同的Whatman 3 mm滤纸和一张尼龙膜浸泡于1×TBE或TAE中。
(3)依次将凝胶、尼龙膜、滤纸和海绵垫叠放在凝胶支持夹中，各层之间不能有气泡滞留。
(4)将凝胶支持夹安放在充满1×TBE或TAE的电转仪中。
(5)尼龙膜一侧置正极，凝胶一侧置负极，300-600mA恒流，4-8h，循环水冷却或置冷室中。
(6)电转移完毕，尼龙膜用1×TBE或TAE漂洗，用干燥滤纸吸干，80℃真空烘烤2h或短波紫外照射固定备用。
3.真空转移法
此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下,凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到置于凝胶下面的固相支持物——尼龙膜或硝酸纤维素膜上。具体步骤如下：
(1)电泳完毕，可以先行脱嘌呤、碱变性，也可以直接进行转移。
(2)在真空转移仪的真空密封膜上剪一与凝胶大小相同或者稍小的窗口。
(3)剪一与凝胶大小相同或稍大的Whatman 3 mm滤纸，用双蒸水浸润，置于上述窗口上。
(4)剪一与凝胶大小相同的尼龙膜或者硝酸纤维索膜，用双蒸水浸润，置于滤纸上, 用玻棒赶去气泡。
(5)将凝胶置于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，赶去气泡。
(6)将真空转移仪封严，用Parafilm封牢凝胶周围，使之不会漏气。
(7)接通真空泵，真空压约5.88 kPa，压力过高，如超过5.88 kPa,则凝胶被压缩, 转移效率反而降低。用变性液覆盖满凝胶，抽气约15 min,随时添加变性缓冲液。
(8)换用中和液，继续抽气约15 min。
(9)转移完毕，硝酸纤维素膜或尼龙膜用去离子水漂洗，然后固定。
真空转移法的最大优点是迅速，可在转膜的同时进行DNA变性与中和，整个过程约需 :30〜60 min。但在操作中应注意两个问题：一是真空压力不能太大，若压力过大，凝胶被压缩，转移效率会降低；二是真空转移液要密封严，防止漏气影响压力的产生。以下展示southern杂交中三种转膜方法的优劣。
~
在进行Southern印迹杂交实验时，观察到阳性反应呈现出明显的带状分布。转膜过程至关重要，确保DNA完全转移到膜上是必不可少的步骤。杂交条件和漂洗步骤对于获得清晰的阳性结果以及良好的背景对比至关重要。如果漂洗不彻底，可能会导致背景信号过强；相反，过度漂洗则可能掩盖真正的阳性信号，造成假阴性结果。在...
抗体需要孵育 直接在胶上的话蛋白早就扩散没了 而且胶各种不方便 容易破碎啥的 当然转到膜上方便啊
Southern Blot：DNA片段通过电泳跑胶分开后，转到膜上。用一段探针（用同位素或者荧光标记）去和目标片段杂交。如果膜上有目标片段，探针就会结合到膜上的特定位置，显影后形成一个条带，条带的大小和目标基因的多少有关。基因文库筛选：转染文库质粒的细菌涂盘生长后，形成克隆。克隆转膜后，用探针去结合...
1 打断DNA，方便转膜（分子太大不好转）2 搭桥关键不要短路
southern其实都是要做标记的。因为样品是很多蛋白（western）或DNA（southern）的混合物，而我们只要看其中的目的条带，所以必须用特定的方法把目的条带标记出来，而其他的条带不显示（比如western的抗原抗体标记，southern的放射性自显影）。这种标记必须在膜上进行，不能直接在胶上进行，所以电泳后必须转膜...
Blot技术，如同一幅科学地图，被划分为DNA（Southern Blot）、RNA（Northern Blot）、蛋白质（Western Blot）和蛋白修饰（Eastern Blot，少见但与Western Blot密切相关）四大区域，各自专注于不同的生物大分子检测。S··B··南方的南方Blot，巧妙地结合了核酸杂交与碱基互补原理，实现基因和蛋白的双重检测...
可以采用质粒DNA作为阳性对照。选择合适的酶进行单酶切，将环状DNA切成直链。在膜上阳性反应呈带状。实验中应注意以下问题，转膜必需充分，要保证DNA已转到膜上。杂交条件及漂洗是保证阳性结果和背景反差对比好的关键。洗膜不充分会导致背景太深，洗膜过度又可能导致假阴性。若用到有毒物质，必需注意环保...
在Northern Blot、Southern Blot、Western Blot中都需要用到NC膜，杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜。 固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过...
但发生过基因重排的细胞DNA的酶切位点有所改变，会产生有别于胚系的DNA酶切片段。转膜后，与标记的DNA探针杂交，如有一定数量的克隆性增殖的淋巴细胞存在(1~5)，克隆性的基因重排条带就可显示出来。对于正常或多克隆性的淋巴细胞增生，由于重排片段大小各异而显弥散带。Southern分析已被应用于IgH、Igk...
反向Northern杂交分析 反向Northern Blotting是将经差异显示得到的扩增后的DNA片段转膜，并分别与来自两个不同细胞系总RNA经反转录制备的32P标记的cDNA第一链探针(reverse transcribed 32P-cDNA prob)进行杂交。
